Uji Sitotoksisitas Pestisida dengan Trypan Blue Dye Exclusion Assay

Penggunaan pestisida menjadi andalan sebagai upaya untuk menekan kerugian di bidang pertanian dan industri bisnis lainnya. Namun, penggunaan pestisida yang berlebihan dan tidak terkendali akan menimbulkan permasalahan lingkungan.

Kondisi ini meningkatkan risiko paparan bahan kimia berbahaya terhadap organisme non-target, termasuk manusia. Paparan pestisida yang sering dan dalam jangka panjang berpotensi menimbulkan dampak kesehatan yang serius pada manusia.

Beberapa bahan aktif di dalam pestisida mungkin saja tidak aman bagi manusia karena bersifat toksik. Oleh karena itu, uji toksisitas pestisida menjadi penting dilakukan sebelum produk dikomersialisasikan.

Uji apa yang bisa dilakukan untuk menjamin keamanan pestisida?

• Trypan Blue Dye Exclusion Assay: Uji Sitotoksisitas Pestisida secara In Vitro
• Keunggulan Trypan Blue DyeExclusion Assayuntuk Uji Sitotoksisitas Pestisida
• Kelemahan Trypan Blue DyeExclusion Assayuntuk Uji Sitotoksisitas Pestisida

Trypan Blue Dye Exclusion Assay: Uji Sitotoksisitas Pestisida secara In Vitro

Trypan blue dye exclusion assay adalah metode sederhana yang dapat digunakan untuk menentukan viabilitas sel (jumlah sel hidup dan mati) dalam suatu suspensi sel. Uji ini dikembangkan sekitar tahun 1975 dengan prinsip uji yang didasarkan pada integritas membran sel setelah diberi paparan zat aktif, dalam hal ini adalah bahan aktif pestisida.

Metode ini adalah salah satu metode pewarnaan selektif untuk sel mati. Sesuai dengan namanya, metode ini menggunakan trypan blue sebagai zat pewarna. Trypan blue merupakan zat warna azo yang tidak dapat menembus membran sel yang utuh, sehingga sel mati yang tidak memiliki membran sel lagi akan terwarnai di metode ini.

Sel hidup (viable cells) memiliki membran sel yang masih utuh, sehingga sel akan mengekslusi trypan blue. Sel hidup akan tampak bening atau tak berwarna ketika diamati di bawah mikroskop cahaya.

Berbeda dengan sel hidup, sel mati atau nekrotik (non-viable cells) mengalami kerusakan membran selnya, sehingga trypan blue dapat masuk ke sitoplasma dan membuat sel tampak berwarna biru saat diamati dengan mikroskop cahaya.

Dalam praktiknya, sel diberi perlakuan senyawa uji seperti organofosfat dengan konsentrasi tertentu sebagai bahan aktif pada pestisida. Setelah itu, sel dicuci atau dibilas untuk menghilangkan sisa senyawa uji, lalu sel disuspensikan pada volume tertentu.

Suspensi sel dicampur dengan trypan blue, lalu campuran dimasukkan ke alat khusus yang disebut sebagai hemacytometer. Viabilitas sel diamati dan dihitung di bawah mikroskop. Viabilitas sel ini dihitung sebagai persentase yang dibandingkan dengan kontrol.

Keunggulan Trypan Blue DyeExclusion Assayuntuk Uji Sitotoksisitas Pestisida

Trypan blue dye exclusion assay menjadi metode yang unggul karena metode ini sederhana dan murah. Metode ini dapat digunakan sebagai penilaian efek toksik pestisida terhadap sel tanpa memerlukan peralatan mahal, sehingga cocok digunakan untuk skrining awal berbagai konsentrasi pestisida.

Hal ini penting terutama pada tahap awal pengembangan atau evaluasi keamanan produk pestisida. Sifatnya yang cepat juga menjadi keuntungan dalam uji sitotoksisitas pestisida.

Kematian sel akibat paparan pestisida dapat segera terdeteksi melalui perubahan warna sel menjadi biru setelah penambahan trypan blue. Dengan demikian, efek toksik akut pestisida terhadap sel dapat diamati dan dibandingkan antarperlakuan dalam waktu yang relatif singkat.

Sifat toksik pestisida terhadap manusia dapat bervariasi, namun gangguan dan kerusakan membran sel merupakan salah satu efek yang paling sering terjadi. Kondisi ini menjadikan trypan blue dye exclusion assay baik untuk mengevaluasi sitotoksisitas pestisida. 

Metode ini berfungsi sebagai indikator integritas membran sel, karena pewarna trypan blue hanya dapat masuk ke dalam sel yang membrannya telah rusak dan menandai sel tersebut sebagai sel mati. Oleh karena itu, metode ini efektif digunakan untuk menilai apakah paparan pestisida menyebabkan kematian sel manusia secara langsung melalui mekanisme kerusakan membran sel.

Kelemahan Trypan Blue DyeExclusion Assayuntuk Uji Sitotoksisitas Pestisida

Pada trypan blue dye exclusion assay penentuan viabilitas sel sangat bergantung pada penilaian visual pengguna. Penghitungan sel dilakukan secara manual menggunakan hemacytometer, sehingga human error sangat mungkin terjadi, terutama saat menghitung banyak sampel.

Metode ini hanya mampu membedakan sel hidup dan sel mati berdasarkan integritas membran sel, tanpa mendeteksi cedera subletal (sub-lethal injury). Akibatnya, sel yang masih hidup tetapi mengalami kerusakan ringan dapat terhitung sebagai sel mati (false-positive), sementara sel dengan membran utuh tetapi sudah tidak mampu tumbuh atau berfungsi dapat terhitung sebagai sel hidup (false-negative).

Karena keterbatasan sensitivitas tersebut, trypan blue dye exclusion assay kurang ideal untuk uji sitotoksisitas in vitro yang membutuhkan deteksi perubahan fungsi sel secara lebih spesifik. Metode ini tidak mampu mengidentifikasi gangguan metabolik, stres oksidatif, atau perubahan fisiologis sel yang terjadi sebelum kematian sel.

Oleh karena itu, hasil yang diperoleh sering kali hanya mencerminkan toksisitas pada tahap akhir. Ada hal yang tak kalah penting, trypan blue diketahui memiliki sifat mutagenik dan karsinogenik, sehingga pada konsentrasi tinggi atau paparan berkepanjangan dapat menimbulkan efek toksik tambahan pada sel.

Paparan ini dapat menyebabkan kerusakan sel bertahap dan menghasilkan perhitungan viabilitas yang kurang akurat. Meskipun trypan blue dye exclusion assay efektif sebagai metode skrining awal, pengujian sitotoksisitas pestisida idealnya tidak berhenti pada satu parameter saja.

Evaluasi keamanan yang komprehensif membutuhkan pendekatan yang lebih terstandar, terukur, dan mampu mendeteksi perubahan sel secara lebih spesifik, baik pada tingkat membran, metabolisme, maupun respons fisiologis lainnya.

Bagi pelaku usaha di bidang agroindustri dan formulasi pestisida, memastikan keamanan produk sebelum dikomersialisasikan bukan hanya soal kepatuhan regulasi, tetapi juga bentuk tanggung jawab terhadap kesehatan manusia dan lingkungan.

Baca juga:
Pentingnya Uji Pestisida Menggunakan Pendekatan In Vitro

Data pengujian yang akurat dan dapat dipertanggungjawabkan menjadi fondasi penting dalam proses registrasi, distribusi, hingga membangun kepercayaan pasar. IML Testing and Research menyediakan layanan pengujian sitotoksisitas dan parameter keamanan lainnya dengan pendekatan laboratorium yang komprehensif, akurat, dan berbasis standar ilmiah.

Melalui dukungan tim ahli dan metode pengujian yang tervalidasi, IML Testing and Research membantu memastikan bahwa setiap produk yang Anda kembangkan telah melalui evaluasi keamanan yang tepat sebelum memasuki pasar.

Konsultasikan kebutuhan pengujian pestisida Anda bersama IML Testing and Research untuk mendapatkan data yang valid, kredibel, dan siap mendukung proses pengembangan maupun registrasi produk Anda.

Author: Dherika
Editor: Sabilla Reza

Referensi:

Aslanturk, O.S. (2018). In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays: Principles, Advantages, and Disadvantages (Chapter 1). IntechOpen, 1-18. http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.71923.

Khanna, A., Bhatele, P., Daya, S.G., Priyanka, G., Vineeta, V., Manoshi, M., & Muskan, K. (2023). An in vitro study of cytotoxicity of organophosphate insecticides (Imidacloprid, Profenofos, Dichlorvos) and natural products (Neem oil and Dashparni ark) on human peripheral lymphocytes by MTT and Trypan blue assay. International Journal of Ayurvedic Medicine, 14(3), 816-823.

Ude, A., Afi-Leslie, K., Kelechi, O., & Emmanuel, O. (2022). Trypan Blue Exclusion Assay, Neutral Red, Acridine Orange and Propidium Iodide. Cytotoxicity, 1-14. Doi: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.105699.