Perbedaan PCR Konvensional dan Real-Time PCR
Metode uji biologi molekuler telah menjadi alat yang sangat penting untuk memastikan keamanan dan efektivitas produk farmasi, kosmetik, dan pangan. Dengan pendekatan yang presisi dan canggih, berbagai jenis instrumen biologi molekuler mampu mendeteksi kontaminasi mikroba, toksisitas, atau potensi efek samping suatu produk secara cepat dan akurat dibandingkan dengan metode konvensional.
Salah satu metode yang sering digunakan dalam analisis biologi molekuler adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) dan real time PCR (RT-PCR). Keduanya memiliki fungsi yang sama, yaitu untuk memperbanyak atau amplifikasi DNA spesifik. Namun, terlepas dari fungsinya yang sama, PCR dan RT-PCR memiliki perbedaan signifikan dalam aplikasi dan pengukuran hasilnya.
Siklus Utama Metode Uji PCR dan RT-PCR
Secara umum, proses amplifikasi DNA target pada teknik PCR dan RT-PCR melibatkan 3 siklus utama yang terdiri dari denaturasi, annealing, dan ekstensi. Ketiga proses tersebut sangat dipengaruhi oleh perubahan suhu yang tepat di setiap tahapannya.
1.Tahap Denaturasi
Pada tahap denaturasi, sampel DNA dipanaskan pada suhu tinggi (94-98°C), untuk memisahkan kedua untai DNA ganda menjadi untai tunggal.
2.Tahap Annealing
Selanjutnya, pada tahap annealing, suhu diturunkan (50-65°C) untuk memungkinkan penempelan primer yang sudah dipilih secara spesifik pada urutan DNA target yang diinginkan.
3.Tahap Ekstensi
Pada tahap ekstensi, suhu dinaikkan lagi (72°C) untuk memungkinkan elongasi untai DNA dengan bantuan enzim polimerase. Siklus ini diulang berkali-kali sehingga jumlah fragmen DNA target cukup banyak untuk dapat dideteksi dan dianalisis lebih lanjut.
Perbedaan Metode Uji PCR dan RT-PCR
Salah satu perbedaan utama antara PCR dan RT-PCR adalah bagaimana hasilnya dianalisis. PCR konvensional, hasil amplifikasi baru bisa dilihat setelah seluruh reaksi selesai dan produk diperiksa menggunakan elektroforesis gel yang memberikan informasi kualitatif mengenai ada atau tidak adanya produk DNA hasil amplifikasi. Dalam hal ini, PCR konvensional lebih bergantung pada analisis pasca-reaksi dengan bantuan validasi menggunakan elektroforesis gel.
Di sisi lain, RT-PCR memungkinkan pengamatan secara langsung (real time) selama reaksi amplifikasi berlangsung. Deteksi sinyal fluoresens yang meningkat seiring bertambahnya jumlah produk amplifikasi digunakan untuk memonitor reaksi secara real-time sehingga data didapatkan dengan lebih cepat dan akurat.
Keunggulan RT-PCR dalam memberikan hasil kuantitatif dibandingkan PCR yang memberikan hasil kualitatif sangatlah bermanfaat dalam berbagai bidang penelitian. Misalnya, dalam penelitian ekspresi gen, RT-PCR memungkinkan peneliti untuk mengukur tingkat ekspresi gen target dalam sel atau jaringan tertentu, yang membantu memahami bagaimana gen tersebut berperan dalam proses biologis atau penyakit. Selain itu, RT-PCR juga digunakan dalam penelitian medis untuk mendeteksi viral load dalam infeksi, seperti pengukuran jumlah virus dalam tubuh pasien dengan infeksi HIV atau SARS-CoV-2.
Meskipun RT-PCR lebih canggih dan memberikan informasi yang lebih cepat, PCR konvensional tetap memiliki keuntungan dalam hal biaya. PCR konvensional lebih murah karena tidak memerlukan peralatan canggih seperti RT-PCR yang menggunakan detektor fluoresens dan bahan kimia khusus untuk mengukur sinyal amplifikasi. Oleh karena itu, PCR lebih sering digunakan dalam aplikasi yang membutuhkan deteksi kualitatif sederhana tanpa memerlukan informasi kuantitatif.
Terlepas dari kelebihan dan kekurangannya, hingga saat ini, teknik PCR konvensional dan RT-PCR masih sangat berguna dalam meningkatkan pemahaman kita tentang biologi molekuler dan aplikasi praktisnya dalam industri farmasi, diagnostik medis, dan penelitian ilmiah. Pilihan antara PCR dan RT-PCR sangat bergantung pada tujuan, kebutuhan analisis, serta anggaran yang dimiliki.
Laboratorium Uji Biologi Molekuler
Di IML Research, kami memahami bahwa keamanan dan efektivitas produk farmasi, kosmetik, serta pangan adalah prioritas utama. Dengan metode uji biologi molekuler seperti PCR dan RT-PCR, kami menghadirkan solusi pengujian yang akurat dan komprehensif. Pendekatan kami mengutamakan ketelitian, keandalan, dan hasil yang dapat dipercaya, sehingga setiap analisis tidak hanya memberikan data, tetapi juga wawasan yang mendukung keputusan Anda. Melalui teknologi yang tepat dan tim ahli berpengalaman, kami berkomitmen membantu bisnis memastikan kualitas produknya dengan standar terbaik.
Author : Rahmidevi Alfiani
Editor : Sabilla Reza Pangestika
Referensi
Bustin, S. A., Benes, V., Nolan, T., & Pfaffl, M. W. (2005). Quantitative real-time RT-PCR–a perspective. Journal of molecular endocrinology, 34(3), 597-601.
Dorak, M. T. (Ed.). (2007). Real-time PCR. Garland Science.
Valasek, M. A., & Repa, J. J. (2005). The power of real-time PCR. Advances in physiology education, 29(3), 151-159.
