Bongkar Rahasia Resistensi Serangga Lewat Uji Lab Metode qPCR
Resistensi serangga terhadap insektisida menjadi tantangan serius dalam pengendalian hama. Deteksi dini terhadap resistensi sangat penting untuk mengevaluasi efektivitas insektisida dan mencegah kegagalan dalam pengendalian hama.
Salah satu metode yang banyak digunakan untuk mengidentifikasi resistensi serangga secara akurat adalah qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction). Metode ini memungkinkan deteksi cepat dan spesifik terhadap gen atau mutasi yang berperan dalam resistensi insektisida.
Artikel ini akan membahas prinsip kerja qPCR dalam mendeteksi resistensi serangga, serta keunggulan dan keterbatasannya dalam penerapan di laboratorium maupun lapangan.
- Metode qPCR untuk Mengukur Efektivitas Insektisida terhadap Serangga
- Keunggulan dan Keterbatasan Metode qPCR untuk Mengukur Efektivitas Insektisida terhadap Serangga
Metode qPCR untuk Mengukur Efektivitas Insektisida terhadap Serangga
qPCR adalah metode yang digunakan untuk mendeteksi dan menganalisis tingkat resistensi serangga terhadap insektisida. Prinsip kerja qPCR dimulai dengan tahap persiapan sampel, di mana DNA atau RNA diekstraksi dari populasi serangga yang sedang diteliti. Jika studi yang dilakukan berbasis RNA, seperti analisis ekspresi gen, maka RNA terlebih dahulu dikonversi menjadi DNA komplemen (cDNA) melalui proses transkripsi balik (reverse transcription).
Setelah itu, pemilihan gen target dilakukan dengan menentukan gen yang berhubungan dengan resistensi terhadap insektisida. Gen yang dipilih akan menjadi penanda dalam proses analisis. Untuk memastikan bahwa amplifikasi berlangsung secara spesifik, primer dan probe dirancang agar hanya mengenali gen target atau mutasi yang terkait.
Dalam qPCR, dua metode utama yang digunakan untuk mendeteksi amplifikasi DNA adalah penggunaan probe TaqMan dan pewarna SYBR Green. Probe TaqMan adalah oligonukleotida spesifik yang diberi label fluoresen dan pemadam (quencher), di mana peningkatan fluoresensi terjadi saat probe terdegradasi selama amplifikasi. Sementara itu, SYBR Green adalah pewarna yang berikatan dengan DNA untai ganda dan memungkinkan deteksi fluoresensi selama proses amplifikasi berlangsung.
Proses amplifikasi dan kuantifikasi dilakukan di dalam termal sikler yang memantau fluoresensi secara real-time. Pada setiap siklus PCR, jumlah DNA target akan berlipat ganda, dan intensitas fluoresensi akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk amplifikasi. Hasil utama yang diamati dalam qPCR adalah nilai siklus ambang (cycle threshold/Ct), yaitu siklus saat fluoresensi melampaui batas yang telah ditentukan.
Tahap akhir dari qPCR adalah analisis data, di mana nilai Ct dibandingkan dengan kontrol yang sesuai, seperti populasi serangga yang rentan terhadap insektisida atau standar yang telah diketahui. Dari hasil analisis ini, dapat ditentukan ada tidaknya penanda resistensi, tingkat ekspresi gen resistensi (jika menggunakan RNA/cDNA), serta variasi jumlah salinan gen, seperti adanya duplikasi gen. Dengan demikian, qPCR dapat memberikan informasi yang akurat mengenai efektivitas suatu insektisida dan membantu dalam pengelolaan resistensi serangga.
qPCR telah berhasil digunakan untuk mendeteksi berbagai gen resistensi insektisida pada populasi serangga. Salah satu contoh utama adalah mutasi kdr pada gen vgsc yang menyebabkan resistensi terhadap insektisida piretroid. Mutasi L1014F pada nyamuk Culex telah terdeteksi dengan akurasi tinggi menggunakan RT-qPCR, memungkinkan pemetaan frekuensi mutasi ini dalam populasi nyamuk. Selain itu, mutasi lain seperti L1014S juga telah ditemukan menggunakan metode molekuler.
Baca juga:
7 Langkah Mengendalikan Nyamuk Di Rumah
Pada Anopheles gambiae, next generation sequencing (NGS) telah mengidentifikasi berbagai SNP pada vgsc yang terkait dengan resistensi insektisida, termasuk V402L, L995F, dan N1570Y. Selain vgsc, mutasi pada gen lain seperti ace1, gste2, dan rdl juga telah terdeteksi menggunakan multiplex PCR dan NGS. Mutasi seperti A296G pada rdl serta beberapa perubahan pada gste2 berkontribusi terhadap resistensi serangga.
Selain mutasi genetik, resistensi juga dapat disebabkan oleh peningkatan enzim detoksifikasi, seperti P450. Pada Spodoptera exigua, ekspresi tinggi dari beberapa gen CYP (CYP6AE97, CYP321A9, dll.) telah dikaitkan dengan resistensi terhadap berbagai insektisida. Mekanisme detoksifikasi berbasis enzim ini telah dilaporkan dalam berbagai studi sebagai salah satu faktor utama dalam resistensi serangga terhadap insektisida.
Keunggulan dan Keterbatasan Metode qPCR untuk Mengukur Efektivitas Insektisida terhadap Serangga
qPCR memiliki beberapa keunggulan yang membuatnya menjadi metode yang efektif dalam mendeteksi resistensi serangga terhadap insektisida. Salah satu keunggulan utama adalah sensitivitas dan spesifisitasnya yang tinggi dalam mendeteksi penanda resistensi. Dengan kemampuan ini, qPCR dapat mendeteksi bahkan jumlah kecil DNA atau RNA target dalam sampel, sehingga memastikan hasil yang akurat dan dapat diandalkan.
Selain itu, qPCR memberikan hasil yang bersifat kuantitatif, yang berarti metode ini tidak hanya mendeteksi keberadaan gen resistensi tetapi juga dapat mengukur tingkat ekspresi gen atau frekuensi mutasi secara tepat. Hal ini sangat berguna dalam mengevaluasi tingkat resistensi suatu populasi serangga terhadap insektisida tertentu. Keunggulan lainnya adalah waktu pemrosesan yang relatif cepat dibandingkan dengan uji biologis konvensional, seperti bioassay, yang sering kali memerlukan beberapa hari atau minggu untuk mendapatkan hasil.
Dengan qPCR, hasil dapat diperoleh dalam hitungan jam, sehingga memungkinkan pengambilan keputusan yang lebih cepat dalam strategi pengelolaan resistensi. Meskipun memiliki banyak keunggulan, qPCR juga memiliki beberapa keterbatasan yang perlu diperhatikan. Salah satu keterbatasan utama adalah perlunya pengetahuan sebelumnya tentang penanda resistensi yang akan dianalisis. Hal ini berarti bahwa sebelum melakukan qPCR, penelitian awal harus dilakukan untuk mengidentifikasi mutasi atau gen spesifik yang berperan dalam resistensi terhadap insektisida tertentu.
Jika informasi ini tidak tersedia, maka qPCR tidak dapat digunakan secara efektif. Keterbatasan lainnya adalah biaya peralatan dan reagen yang relatif mahal, yang dapat menjadi kendala dalam penerapan qPCR di lapangan atau di laboratorium dengan sumber daya terbatas. Mesin qPCR memerlukan investasi besar, serta reagen yang digunakan, seperti probe dan enzim, juga memiliki harga yang cukup tinggi. Hal ini membuat qPCR lebih cocok untuk digunakan di laboratorium yang telah memiliki fasilitas yang memadai dan bukan sebagai metode deteksi lapangan yang mudah diakses.
Dengan semakin meluasnya kasus resistensi serangga terhadap insektisida, pendekatan berbasis data menjadi semakin penting. Metode qPCR memungkinkan deteksi gen resistensi secara cepat dan akurat. Lakukan pengujian di lab uji efikasi pestisida yang terpercaya untuk memastikan efektivitas insektisida Anda sebelum kegagalan pengendalian terjadi.
Author: Dherika
Editor: Sabilla
Referensi:
Acford-Palmer, H., Phelan, J.E., Tadesse, F.G. et al. (2023). Identification of two insecticide resistance markers in Ethiopian Anopheles stephensi mosquitoes using a multiplex amplicon sequencing assay. Sci Rep, 13(5612), 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-023-32336-7.
Biswas, T. (2023). Insights into qPCR: Protocol, Detection Methods, and Analysis. Retrieved from https://www.the-scientist.com/insights-into-qpcr-protocol-detection-methods-and-analysis-71478 (Accessed: March 2nd, 2025).
Campos, M., Phelan, J., Spadar, A. et al. (2022). High-throughput barcoding method for the genetic surveillance of insecticide resistance and species identification in Anopheles gambiae complex malaria vectors. Sci Rep, 12(13893), 1-11. https://doi.org/10.1038/s41598-022-17822-8.
Kralik, P., Ricchi, M. (2017). A basic guide to real time PCR in microbial diagnostics: definitions, parameters, and everything. Front. Microbiol. 8(108), 1-9. Doi: 10.3389/fmicb.2017.00108.
Siddiqui JA, Fan R, Naz H, Bamisile BS, Hafeez M, Ghani MI, Wei Y, Xu Y and Chen X. (2023). Insights into insecticide resistance mechanisms in invasive species: Challenges and control strategies. Front. Physiol, 13(1112278), 1-18. Doi: 10.3389/fphys.2022.1112278.
